זו אולי אחת השאלות הנפוצות ביותר ששואלים אותי מאז שאני מנהלת את התחום של מערכות טיהור מים למעבדות ובצדק... מדידת pH במים נקיים איננה דבר טרויאלי, שכן מדידת pH ע"י אלקטרודה מתאימה תלויה בהולכת היונים H+/ OH- ובמים נקיים ריכוז היונים כל כך נמוך שהדבר מקשה על המדידה.
מתי זה משפיע על העבודה שלך במעבדה? pH משפיע על תגובות כימיות ואנזימתיות, ולכן במרבית המעבדות יש צורך למדוד pH, ובד"כ גם להשתמש בתמיסות בופר. את התמיסות האלה מכינים בדרך כלל עם מים נקיים בדרגת שימוש ultrapure, או בשמם המוכר יותר MilliQ water, במטרה לצמצם את הסיכון של זיהום הבופר מאי ניקיונות של המים. עוד על מיהול תמיסות בופר וההשפעה של המיהול על ה-pH בהמשך הפוסט.
רענון קצר של יסודות בכימיה, ואיך זה משפיע על קריאת הpH?טבלה מספר 1 מרכזת את הנוסחאות המשמשות לחישובים הרלוונטים.pH של מים מוגדר כמינוס לוג של ריכוז יוני המימן (משוואה מספר 1). מעשית, במים נקיים pH=7 בטמפרטורה ש 250c, הערך התיאורתי הינו 6.998 משוואה מספר 2 מתארת את השווי משקל הכימי של מים, ומשוואה מספר 3 מתארת את קבוע היוני של המים. למרות שידוע ממשוואות אלו כי ריכוז יוני ה- H3O הינו 10–6.998 mol/L, לא ניתן למדוד ערך זה בטבילה פשוטה של אלקטרודה במבחנה מלאה מים נקיים. המדידה באלקטרודה לא אפשרית בגלל חוסר ביונים אשר יאפשרו מעבר אלקטרונים משני צידי האלטרודה, והדבר גורם לכך שנראה כי "האלקטרודה משתגעת" או נותנת קריאות חסרות משמעות.
הוספת חומצה או בסיס (אפילו בכמות קטנה) תשנה את החומציות של המים באופן דרסטי כפי שניתן לראות באיור מספר 1. זה בדיוק מה שקורה כאשר פחמן דו חמצני מתמוסס במים, ויוצר חומצה (בתגובת שיווי משקל המתוארת בנוסחא מספר 4 בטבלה 1). התהליך מוריד את הpH של המים עד לשיווי משקל לבערך 5.8. זה הערך שיתקבל בסופו של דבר במדידה בתנאים לא מבוקרים של מים נקיים, שיעמדו בכלי פתוח במעבדה.
Figure 1 - Theoretical resistivity values of water following the addition of hydrochloric acid (HCl) or sodium hydroxide (NaOH). The resistivity of ultrapure water is 18.18 MΩ.cm and the pH is 6.998.
איך בכל זאת אפשר למדוד pH במים נקיים?הנושא של מדידת pH במים נקיים מקבל התיחסות בארגוני תקינה שונים:הפרמקופיאה האמריקאית ממליצה על הוספת פוטסיום כלוריד (KCl) למים, כדי להעלות את המוליכות של התמיסה, ובכך לאפשר מדידה של יוני ה- +H30. אישית, זהו הפתרון החביב עלי, כיוון שהוא הפשוט ביותר ומתאים לרוב המעבדות (בודאי פשוט יותר מהפתרון של ה-ASTM הכולל מדידה בזרימה).
לפי הISO, תקן 3696, פשוט אין צורך למדוד pH במים נקיים, והם מסתמכים על מדידה פיסיו-כימית של מוליכות: מדידת מוליכות יכולה לשמש כאלטרנטיבה למדידת pH במים מאוד נקיים. המוליכות של המים מתוארת בנוסחה מספר 5 בטבלה 1 וכוללת את הקשר בין התנגדות (אחד חלקי מוליכות) וpH של מים. במים נקיים, במוליכות 0.055 S.cm–1 at 25 °C (או בהתנגדות 18.18 MΩ.cm) קיימים רק יונים של שיווי משקל של מים כפי שמתואר בנוסחה מספר 2, ולכן ניתן להסמך על כך שבמים נקיים,ערך הpH הינו בקירוב טוב 7 (או אם רוצים לדייק - 6.998.).
מיהול תמיסות בופרבחודשים האחרונים שוחחתי על כך עם חוקרים וחוקרות ממעבדות מובילות (גם באוניברסיטת תל אביב וגם במכון וייצמן); לעיתים קרובות מכינים במעבדות תמיסת סטוק אשר משמשת להכנות הבופרים במעבדה, ורואים שה-pH של התמיסה הסופית שונה מזה של תמיסת הסטוק (המרוכזת).ההסבר לכך הוא תיאורטית פשוט: pH של תמיסת בופר, המורכבת מחומצה חלשה והבסיס המצומד שלה, קשור לקבוע המסיסות (pKa) כמו שאפשר לראות בנוסחה מספר 6 בטבלה 1. לפי ההגדרה, בופרים עמידים לשינויים גדולים בpH, אך למרות זאת, במעבדה אפשר לראות שמעשית מיהול של בופר עם מים נקיים כמו MilliQ Water משפיע על ה-pH של התמיסה. כמה פרמטרים יכולים להסביר זאת:
1. טמפרטורה קבועי שיווי משקל ומקדמי פעילות הינם מקדמים המשתנים עם שינוי טמפרטורה, אשר גורם לערכי pKa , pH של הבופר להשתנות. מקדמי הטמפרטורה יכולים להשתנות משמעותית כתלות בסוג הבופר לדוגמא: –0.028 pH/°C for Tris and –0.0028 pH/°C for phosphate. מסיבה זו בד"כ מציינים את ערכי הטמפרטורה של התמיסה יחד עם ערכי הpH.גם ערכי הpH של המים עצמם אגב, משתנים עם הטמפ':7.27 at 10 °C, 7.00 at 25 °C, and 6.63 at 50 °C.
2. קיבולת בופר זוהי היכולת של הבופר לעמוד בשינויי pH. תכונה זו תלויה בריכוז הכולל של יחס חומצה/בסיס מצומד, והוא גבוה ככל שהתמיסה מרוכזת יותר.
3. חוזק יוני החוזק היוני מתאר את כמות המטען החשמלי בתמיסה. זוהי פונקציה של ריכוז ושל ערכיות היונים בתמיסה. ריכוז יוני גבוה נוטה להגביל את המוביליות של יוני המימן מה שמוריד את הפעילות שלהם ומשפיע על מדידת ה-pH.
4. מיהול מתקשר לירידה בחוזק היוני, מיהול משפיע ישירות על pH של התמיסה. לדוגמא, מיהול בופר 0.1 M בנפח זהה של מים, יגרום לשינוי של 0.024 יחידות pH. בבופר פוספאט השינוי הוא פי 3 (המטען של היונים).
הנושא מוכר וידוע, וכבר לפני יותר מעשור חוקרי המו"פ של Merck (לשעבר מיליפור) פרסמו את הניסוי הבא, אשר תוצאותיו מתוארות באיור מספר 2:בניסוי מהלו פי 10 ופי 100 שני בופרים מבוססים פוספאט במים באיכויות שונות ומדדו את הpH הסופי. שתי תמיסות בופר הפוספאט היו בופר פוספאט 1.0 mol/L, pH 7.4, ובופר PBS 0.1 mol/L (pH אחרי מיהול פי 10 צפוי להיות 7.2-7.6). המיהולים נעשו עם שלושה סוגי מים: מים בדרגת ultrapure – מי תוצר של MilliQ. מים בדרגת שימוש pure – מי תוצר Elix, ומים מזוקקים מבקבוקים. כל הניסוי בוצע בטריפליקט.ניתן לראות באיור את תוצאות הניסוי: מיהול בופר הפוספאט במים נקיים גרם לעלייה בpH. עבור כל בופר השינויים היו דומים בכל שלושת סוגי המים. השינויים היו גדולים יותר בPBS לעומת בופר הפוספאט בגלל הריכוז ובגלל החוזק היוני.
Figure 2 - Effect of phosphate buffer dilution with high-purity water. Values shown are the mean and standard deviation of three samples: a) phosphate buffer (1.0 mol/L, pH 7.4), b) 10× phosphate buffered saline (PBS, 0.1 mol/L).
לסיכום, קשה למדוד pH במים נקיים, הריאגנט הנפוץ ביותר במעבדה. כדי להתגבר על קושי זה ניתן להשתמש בהתנגדות של המים (18.2 MΩ.cm at 25 °C) כדי לדעת מהו ערך הpH (קרוב מאוד ל 7.0).מיהולים של תמיסות סטוק של בופרים עם מים נקיים יביאו לשינוי בערכי ה-pH. השינויים האלו בערכי הpH הינם בלתי נמנעים וניתן להסביר אותם ע"י החוזק היוני וקיבולת הבופר.המידע המדעי, הגרפים והטבלאות בפוסט זה נלקחו ממאמר שפורסם בכתב העת American Laboratories . המחקר בוצע ע"י חוקרים במחלקת המו"פ של Milli-Q Lab Water Solutions בחברת Merck.https://www.americanlaboratory.com/913-Technical-Articles/35755-High-Purity-Water-and-pH/תכלת קובצ'י רבינוביץ,מנהלת תחום מערכות מים למעבדות במרקורי052-3632489[email protected]מחברת המאמר תכלת קובצ'י רבינוביץ בוגרת תואר ראשון B.Sc. ושני M.Cs בהנדסת ביוטכנולוגיה ומזון בטכניון.• במסגרת עבודת המחקר לתואר השני, הכירה ועבדה במגוון של טכנולוגיות מתחומי הכימיה והביולוגיה. מתחומי הכימיה, בעיקר סינתזת פפטידים solid phase peptide synthesis, HPLC אנליטי וסמי פרפרטיבי, כולל LCMS; מתחומי הביולוגיה עבודה עם חיידקים, MIC ובדיקת פיתוח עמידות לחומרים אנטי מיקרוביאלים, ומעט עבודה עם תרביות תאים.• תכלת עובדת במרקורי מ 2009 ומכירה היטב את צרכי הלקוחות בתחומים השונים, על פי אופי העבודה במעבדות השונות החל ממעבדות פארמה ועד למעבדות אקדמיה. בשנים 2009-2012 כמנהלת מכירות לתחומי הכימיה, בהמשך מ 2012 עד 2015 כמנהלת מכירות למוצרי מדעי החיים והחל מ - 2015 כ - Product specialist לתחום מערכות המים.• במהלך השנים כמנהלת מכירות השתלמה תכלת במגוון נושאים מקצועיים בתוך מרקורי, וכן מ - 2016 ועד היום משתלמת תכלת בקורסים מקצועיים המועברים במטה Merck Millipore בצרפת, בתחום המים למעבדות.בהשתלמויות אלו משתתפים מנהלי מוצרים מתחום המים למעבדות מכל העולם, תכלת אחראית להבאת הידע העדכני והרלוונטי ביותר ללקוחות בארץ.