Demonstrating sensitivity (precision)
• Demonstrating reproducibility (precision)
• Demonstrating target specificity (accuracy)
• Demonstrating application specificity (accuracy)
ארבעת המאפיינים האלו מגדירים איזו אנליזה נדרשת על מנת לקבל ולידציה איכותית לנוגדן.
שמתכננים ניסוי חשוב לנקוט במשנה זהירות בבחירת המרכיבים ל- Immunoassay. למשל, כשבוחרים את הנוגדן - - מהו אנטיגן המטרה? - האם הוא פנימי, חיצוני, טרנס ממברנלי או מופרש מהתא? - האם חשובה לנו הצורה הנטיבית של חלבון? - האם המטרה היא לזהות, לכמת, למקם או גם וגם?
חשוב שהפקטורים הנ"ל יהיו חלק הן מפיתוח איכותי והן חלק מתהליך בחירת הנוגדן.ברגע שזוהה האנטיגן ונבחרה שיטת הדטקציה הגיע הזמן לבחור נוגדן ראשוני אחד או יותר על מנת לזהות את האנטיגן שלך בהתחשב בפקטורים הבאים:
לכל שיטה (western blotting, immunohistochemistry, ELISA, flow cytometry, etc.,), יש יתרונות וחסרונות משלה. מכיון שלא כל נוגדן יכול להתאים לכל אחת מהשיטות, לא ניתן להחשיב נוגדן כלא טוב אם הוא עובד בIB ולא ב IH.חשוב מאוד לעשות ולידציה לנוגדן שלך לשיטה הספציפית שלך. מומלץ לבדוק את הנתונים המופיעים ב Data Sheet או באתר היצרן על מנת לראות איזה נתוני ולידציה ניתן לקבל על השיטה שבה מעוניינים. כל פרסום מדעי יכול לחזק את הבטחון בשימוש בנוגדן, וכן יכול לאיזה שיטות הנוגדן יכול להתאים.
קימים מספר נתוני מפתח חשובים אודות חלבון המטרה שיכולים להשפיע באופן משמעותי על ביצועי הנוגדן.
זמינים במידה וידרשו לפרסום מאמרים. להלן מספר נקודות שכדאי לקחת בחשבון בהקשר הזה:נתוני היצרן עיינו ב Data sheet, ב Certificate of analysis ונתונים המוצגים באתר הספק/ היצרן. בדקו האם נעשתה רק בדיקה לזיהוי האנטיגן בשיטות השונות למשל ELISA או WB, או האם יש נתונים מעמיקים יותר. בדקו איזה סוג דוגמאות נבדקו(ליזט מתאים, הומוגנט מרקמות וכו') ותחת אילו תנאים (ריכוז הנוגדן, סטימולציה, ריכוז הליזט וכו') נעשתה הבדיקה.
זיהוי של חלבונים רקומביננטיים למשל לא מבטיחה זיהוי של החלבונים מתאים או מרקמות.
יקורותתמיד כדאי שבביקורות תהיינה גם ביקורת שלילית וגם ביקורת חיובית. ביקורת חיובית יכולה להיות כל רקמה, תרבית תאים, או חלבון נקי שידוע שמכיל את האנטיגן ונבדק כבר ע"י שיטה אמינה. ביקורת שלילית הינה דוגמה שידוע שאינה מכילה את האנטיגן. בנוסף לביקורות, כדאי להריץ את הריאגנטים בלבד כביקורות לנוגדן הראשוני והשניוני. גם ביקורות לאיזוטיפ כדאי שיהיו על מנת להראות שהקישור של הנוגדן הראשוני הוא ספציפי ולא מביא לרקע כתוצאה מקישור לא ספציפי.
לסיכום, כיול של נוגדנים הוא מפתח לביצוע נכון של ניסויים ולאחריהם לפרסום מאמרים עם נתונים מבוססים ונכונים. בכיול המעבדה בודקת את הביצועים של הנוגדן ומאפיינת את הביצועים שלו בשיטות השונות. תכנון נכון של ניסויים של יצרני הנוגדן ושל המשתמשים בו חשובים מאוד לפענוח נכון של התוצאות. בעבודה עם נוגדנים אנחנו מנצלים את אופי פעולתם המדויק, בוטחים בתכונות אלה ומתבססים עליהם בנסיונות שלנו. יחד עם זאת עלינו לכייל נכונה את הנוגדנים בהם אנחנו משתמשים ולהיות מודעים לחשיבות של תכנון נכון של ניסוי עם שימוש נכון בנוגדנים על מנת לפענח נכון את התוצאות של הניסויים שלנו. אשמח לעזור בבחירת הנוגדן למחקר שלך, מירב[email protected]
Reference:
Further considerations of antibody validation and usage. How to avoid reviewer challenges.By Kevin Long, Ph.D.; Chandra Mohan Ph.D.; Wayne Speckmann, Ph.D.
EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA
מחברת המאמר, מירב גרבי הינה בוגרת תואר ראשון בביולוגיה B.Sc. ותואר שני M.Sc. בביוכימיה מאוניברסיטת בר אילן.• למירב גרבי ניסיון של 3 שנים בעבודת מחקר במחלקה ל Cellular and Developmental Biology בביה"ס לרפואה New York, Mount Sinai School of Medicine • במסגרת עבודה זו חקרה את ההבדלים בין Fibroblast growth factors -FGFs לבין FGF homologous factors FHFs ע"י השריית מוטציה בחלבונים רקומביננטיים והכנה פרפרטיבית של החלבונים לאנליזה בקריסטלוגרפיה.• למירב מומחיות בשיטות: ביולוגיה מולקולרית, יצירת קונסטרקטים , RT-PCR, PCR טרנספקיות וטרנספורמציות, ביטוי חלבונים בחידקים, מיצוי חלבונים, טיהור חלבונים בקולונות אפיניות להפרין, ניקל וגלוטטיון, פתרון בעיות אגרגציה ופרסיפיטציה של חלבונים, אנליזת חלבונים בשיטת ווסטרן, צביעות קומסי וצביעות כסף של ג'לים, טרנספקציה לתרביות תאים, מבחני MTT לתרביות תאים ועוד.• מ - 2006- מנהלת את תחום מדעי החיים בחברת מרקורי לאחר שבמשך כעשור ניהלה גם את תחום הכרומטוגרפיה • מירב גרבי השתתפה בקורסים והשתלמויות בתחומים: כרומטוגרפיה, מיקרוסקופיה ומדעי החיים בחברת Merck .