אקסוזומים הינם מתווכים בין תאים ונוטלים חלק בסרטן, טרשת נפוצה ומחלות נוספות, מה שמצביע על יכולתם להיות מדדים דיאגנוסטייםלמחלה וכן כפקטורים לריפוי מחלות, במיוחד דרך תרפיה גנטית. למשל בטרשת נפוצה מחקר שבוצע ע"י ה NIH – הסוכנות האמריקאית למחקר רפואי - גילה שהאקסוזומים מופרשים על ידי התא באופן טבעי,וגורמים לתאים במוח להתחיל לשקם את המיאלין.אקסוזומים אלו מגנים על המוח מפני השפעות ההזדקנות ומחלות ניווניות, ומופרשים, בין השאר, בזמן העשרה סביבתית של המוח,כגון פעילות אינטלקטואלית, חברתית ופיזית מגוונת. המחקר נערך תוך שימוש באקסוזומים אשר יוצרו במעבדה - ע"י גירוי של תאים ממערכת החיסון שמקורם במוח העצם.בעזרתם הדגימו החוקרים יצירה מחודשת של מיאלין ושיקום רקמות המוח של חולדות אשר דימו פלאקים (איזורים) של טרשת נפוצה.
בפוסט זה בחרתי לכתוב על אקסוזומים בשל חשיבותם העולה עם התקדמות המחקרים בתחום.
ExosomeIsolation & Analysis
כיצד מפיקים אקסוזומים במעבדה?
אקסוזומים הינם ננו-שלפוחיות בקוטר של 30 עד 100 ננומטר שמופרשים ע"י רוב סוגי התאים בתנאים נורמליים או פתוגניים. הם נוצרים עי הנצה של ממברנה של אברונים פנימיים היוצרים Multivesicular Bodies (MVBS) שבסופו של דבר מתאחים עם ממברנת הפלסמה ומשחררים את הוסיקולות לתוך החלל הפנימי ואלה נודדות לתאי מטרה רחוקים. האקסוזומים מכילים מגוון רחב של חלבונים שמקורם בפלסמת הממברנה, באברונים אחרים או בציטוזול.אקסוזמים יכולים להכיל ליפידים, mRNA ו- micro-RNA, מה שהופך אותם להליך חשוב בחקר העברת האותות בתהליכיםפיזיולוגיים הכוללים שגשוג גידולים, אנגיוגנזיס ומטסטאזיס, ולכן הינם מקור נצרך וחשוב לביומרקרים ולאבחון וטיפול במחלות שונות. כידוע, איכות הפקת הדוגמה משפיעה בסופו של דבר על התכליכים והאנליזות שעוברת הדוגמה ולכן חשוב לקבל דוגמאות טהורות כמה שניתן.זה במיוחד נכון כשמחפשים חלבונים נדירים שכמותם קטנה, כמו במקרה של האקסוזומים.בנוסף לקבלת דוגמה נקיה גם חשוב שניתן יהיה לחזור על תהליך ההפקה ושהתוצאות יהיו מדויקות והדירות.חוקרים בתחום הפיקו אקסוזומים ממדיום לגידול תאים בתרבית וכן מנוזלי גוף כגון שתן, פלסמה, רוק או חלב אם.הנוחות שבקבלת דוגמה כזו מנוזלי גוף מקלה במעט על התהליך מכיון שהפקת האקסוזומים בעצמה הינה אתגר לא פשוט.חלק מהקושי נובע כתוצאה מנוכחות של חלבונים שכיחים שממסכים על החלבונים הנחקרים וכן בשל הדינאמיקה שבמגוון החלבונים שמתבטאים.להפקתם בדרך כלל משתמשים באולטראצנטריפוגה בתהליך שיכול להיות ארוך ואינטנסיבי.שיטות אחרות בסקאלה קטנה נעשות ע"י ניקוי באפיניות לנוגדנים בבידים מגנטיים ואנליזה ב- FACS, או השקעה בתמיסות מסחריות מוכנות.בחרתי לעניין אתכם בפוסטר של Sara Gutierez ושותפיה המציגים שיטה של הפקת אקסוזומים ממדיום של תאיםבתרבית עי אולטראפילטרציה, ובהמשכה השקעה עם נוגדנים וניקוי עי בידים מגנטיים ואנליזה עם FACS. שיטה היכולה להוות השלמה לשיטות האחרות. שיטה זו מבוססת על מאמר של Cheruvansky et al.,כאשר בשיטה הנוכחית ביצעו מספר מודיפיקציות.
עיקרי השיטה להפקת אקסוזומים :
1. גדלו תאים במדיום עם FBS ואספו את המידיום. מדדו את ריכוז התאים נמדד ע"י Scepter™ - 2.0 Cell Counter שהוא מכשיר ידני אוטומטי מהיר לספירת תאים.
2. שטפו את התאים ב-PBS וביצעו ליזיס ע"י (CytoBuster™ Protein Extraction Reagent) שמכיל קוקטייל מעכבי פרוטאזות.
3. בצעו לליזט הומוגניזציה למספר שניות בהומוגניזר והשקיעו בצנטריפוגה ל 10 דק.
4. הפקת האקסוזומים: סיננו את התאים וחלקי התאים עי העברתם בפילטר מסוג Steriflip עם 0.2um Cell_Culture_and_Systems_SCGP00525
5. אולטראפילטרציה: רכזו את הדוגמאות ב- Amicon® Ultra 2 מ"ל עם 3/10/100kDa או ב- Amicon® Pro. בכל המקרים הדוגמאות סורכזו ב- g נמוך של 1000 למשך 15-30 דקות.
למידע נוסף על Amicon מומלץ לצפות בסרטון אינפורמטיבי אודותיו
6. השקעה של אקסוזומים: אחרי הריכוז ב- Amicon® Ultra או ב- Amicon® Pro סננו את התוצר ב- Steriflip 0.2um. לקחו 1 מ"ל של הנוזל המסונן והמרוכז, איחדו והדגירו ללילה עם 500 מיקרוליטר של תמיסה לבידוד אקסוזומים.
7. ריכוז וזיהוי חלבון :נמדד ע"י ספקטרופוטומטר ®Direct Detect שמאפשר בדיקה של ריכוז חלבונים וגם של שומנים. זיהוי של CD63 ע"י FACS: המדיום המועשר באקסוזומים (שרוכז) הודגר עם בידים מגנטיים עם human CD63. לאחר 12-24 שעות שטפו את הבידים הרחיפו ב-PBS עם והדגירו למשך שעה עם נוגדן anti human CD63.
8. לאחר שטיפות הדוגמאות בידקו ב- Guava® easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer.
9. אלקטרופורזיס וווסטרן: הטעינו את הדוגמאות והעבירו בטרנספר ל- Immobilon P במערכת Semi Dry . השטיפות וההדגרות של הממברנה ניתן לעשות עם SNAP i.d.® 2.0. הנוגדנים היו כנגד CD63 / CD9/ EpCAM-1/ AIP1/Alix. וזיהוי ע"י Luminata Forte.
10. אימונופרסיפיטציה: השתמשו בבידים מגנטיים - PureProteome™ Protein A Magnetic Bead לבודד את החלבון CD63 מהאקסוזומים שבמדיום התאים.
לסיום צפו באקסוזומים שלמים במיקרוסקופ אלקטרוני כמפורט בפוסטר על מנת להוכיח את נוכחותם ואת שיטת ההפקה.
לסיכום בשימוש בשיטה של אולטראפילטרציה שפורסמה ע"י Cheruvanky et al בשילוב עם סינון ב- Steriflip התקבלה שיטה מהירה ונוחהלהפקת אקסוזומים ממדיה של תרביות תאים. שיטה היכולה להוות השלמה להפקת אקסוזומים באולטראפילטרציה.תוכלו לעיין גם בפוסטר נוסף שדן בהפקת אקסוזומים באולטראפילטרציה: A centrifugal ultrafiltration-based method for enrichment of microvesiclesלנוחיותכם פירוט הנוגדנים:CBL553 | Anti-CD63 Antibody, clone RFAC4 - Anti-CD63 Antibody, clone RFAC4 is an antibody against CD63 for use in FC, IP, WB, IH, IH(P).CBL162 | Anti-CD9 Antibody, clone MM2/57 - Anti-CD9 Antibody, clone MM2/57 detects level of CD9 & has been published & validated for use in FC, IP, WB, IH.OP187 | Anti-EpCAM-1 (Ab-1) Mouse mAb (VU-1D9) - Anti-EpCAM-1 (Ab-1), mouse monoclonal, clone VU-1D9, recognizes the ~40 kDa EpCAM-1 in squamous cell carcinoma. It is validated for use in WB, FC, IP, and IHC (frozen and paraffin sections).ABC40 | Anti-AIP1/Alix Antibody - Anti-AIP1/Alix Antibody is an antibody against AIP1/Alix for use in WB & IC.CBL579 | Anti-CD81 Antibody, clone I.3.3.22 - This Anti-CD81 Antibody, clone I.3.3.22 is validated for use in FC, IP, FUNC for the detection of CD81.אשמח לענות לשאלותמירב[email protected]
מחברת המאמר, מירב גרבי הינה בוגרת תואר ראשון בביולוגיה B.Sc. ותואר שני M.Sc. בביוכימיה מאוניברסיטת בר אילן.• למירב גרבי ניסיון של 3 שנים בעבודת מחקר במחלקה ל Cellular and Developmental Biology בביה"ס לרפואה New York, Mount Sinai School of Medicine • במסגרת עבודה זו חקרה את ההבדלים בין Fibroblast growth factors -FGFs לבין FGF homologous factors FHFs ע"י השריית מוטציה בחלבונים רקומביננטיים והכנה פרפרטיבית של החלבונים לאנליזה בקריסטלוגרפיה.• למירב מומחיות בשיטות: ביולוגיה מולקולרית, יצירת קונסטרקטים , RT-PCR, PCR טרנספקיות וטרנספורמציות, ביטוי חלבונים בחידקים, מיצוי חלבונים, טיהור חלבונים בקולונות אפיניות להפרין, ניקל וגלוטטיון, פתרון בעיות אגרגציה ופרסיפיטציה של חלבונים, אנליזת חלבונים בשיטת ווסטרן, צביעות קומסי וצביעות כסף של ג'לים, טרנספקציה לתרביות תאים, מבחני MTT לתרביות תאים ועוד.• מ - 2006- מנהלת את תחום מדעי החיים בחברת מרקורי לאחר שבמשך כעשור ניהלה גם את תחום הכרומטוגרפיה • מירב גרבי השתתפה בקורסים והשתלמויות בתחומים: כרומטוגרפיה, מיקרוסקופיה ומדעי החיים בחברת Merck .