עושים Western Blot אחרי IP?

עושה WB אחרי IP (אימונופרסיפיטציה) ?
מה לעשות כשהשרשרת הקלה או הכבדה ממסכות על החלבון שלך ? 

בניסויי אימונופרסיפיטציה (IP), משקיעים את חלבון המטרה בעזרת נוגדן ספציפי .
נוצר קומפלקס נוגדן-חלבון שנקשר לבידים protein A/G.
כדי לבצע אילוציה של חלבון המטרה משתמשים בבופר דנטורציה .
כתוצאה מדנטורציה גם שרשראות הנוגדן משתחררות מהבידים כמו גם חלבון המטרה שמשתחרר.
מתקבלת במבחנה תערובת של חלבונים ושרשראות נוגדן קלה וכבדה בגדלים 25kda, 50kda .
במידה וגודל חלבון המטרה זהה לגודל אחת מהשרשראות – הבנדים ב-WB ימסכו על זיהוי החלבון שלך.

יש כמה דרכים להתגבר על בעיה זו –
1. קישור קובלנטי של בידים מגנטיים לנוגדן
     a. קישור קובלנטי ל- Protein A/G PureProteome™
     b. קישור קובלנטי ל- PureProteome™ NHS
2. הגבת הממברנה עם נוגדן שניוני protein A/G – HRP
3. שימוש בנוגדנים מ-host שונה – לדוגמא – ארנב ל-IP, עכבר ל-WB

 1 a. קישור קובלנטי של בידים מגנטיים PureProteome™ Protein A/Protein G לנוגדן

בידים מגנטיים ל-IP מיליפור:
LSKMAGA02 - PureProteome™ Protein A Magnetic Bead System
LSKMAGG02 - PureProteome™ Protein G Magnetic Bead System

הקישור הקובלנטי מתאפשר באמצעות אמינים פעילים כגון BS3 , DSS, DMP .
הם מגיבים עם האמינים הראשוניים שמצויים ב-Protein A/G ובנוגדן.
כך נוצר קשר אמידי יציב בין הנוגדן ל- PureProteome™ Protein A, G, A/G שעל הבידים.
בעוד ש- BS3 ו-DMP מסיסים במים, את DSS יש להמיס ב-DMSO או DMF.
בקישור תוכלו למצוא פרוטוקולים שונים לקישור PureProteome™ Protein A, G, A/G לנוגדן.

יתרונות של בידים מגנטיים PureProteome –

• יעילות קישור הכי גבוהה:
  Protein A binds 1.5-2.5 mg of rabbit IgG per mL - of suspension
  Protein G binds 2.5-3.5 mg of rabbit IgG per mL - of suspension
  Protein A/G mix binds 2-3 mg of rabbit IgG per mL - of suspension
  
  
• ללא קישור לא ספציפי

          אופציה שנייה היא להזמין מראש בידים מגנטיים עם קצה אמיני חופשי הנקראים –
          PureProteome™ NHS FlexiBind Magnetic Beads 

1 b. שימוש בבידים מגנטיים PureProteome™ NHS - PureProteome™ NHS Flexibind Magnetic Beads:
בידים מגנטיים NHS מיליפור:
LSKMAGN01 - PureProteome™ NHS FlexiBind Magnetic Beads Kit
LSKMAGN04 - PureProteome™ NHS FlexiBind Magnetic Bead System

בעזרת בידים מגנטיים עם קבוצה אמינית חופשית NHS ניתן לקשור קובלנטית ליגנדים שונים כמו חלבונים, נוגדנים ומולקולות נוספות המכילות אמינים ראשוניים.

בקישור תוכלו למצוא פרוטוקול לשימוש בבידים מגנטיים PureProteome™ NHS FlexiBind .
אפליקציות נוספות אפשריות עם הבידים: cell depletion, immunoprecipitation, protein purification, affinity enrichment.
יתרונות 

• מוכן לשימוש
  
• צפיפות גבוהה של NHS לצימוד.
  
• קישור קובלטי יציב.
  
• ניתן לשימוש ב-pH 4.5-9 ובטמפ' - 4–25 °C
  
  2. הגבת הממברנה עם protein A/G – HRP במקום נוגדן שניוני:
  18-160 - Protein A, HRP conjugate
  18-161 - Protein G, HRP conjugate
  בתהליך הדנטורציה של הדוגמא, כל החלבונים עוברים שינוי מבני כולל שרשראות נוגדן ה-IP שהיה קשור ל-protein A/G. ולכן ברגע שנשתמש ב- protein A/G – HRP, לא יהיה זיהוי של השרשרת הכבדה (יהיה זיהוי רק של הנוגדן הראשוני שהגבנו בממברנה).
  כדי לבחור האם אתה צריך Protein A-HRP או Protein G-HRP – יש להסתכל על טבלת האפיניות הבאה :
  

מחברת המאמר, עדי ג’רבי הינה בוגרת תואר ראשון בביולוגיה B.Sc. ותואר שני M.Sc. בביוטכנולוגיה מאוניברסיטת בר אילן.
• עדי עובדת בחברת מרקורי משנת 2014 בצוות מדעי החיים. ויש לה ניסיון בבביולוגיה מולקולרית ובתחומים  הבאים: Cloning, PCR, RNA extraction, RT-PCR, Protein extraction purification and   concentration, Western blot, FACS, Cell culture, migration and invasion methods ,  3D Organotypic culturing, Filtration solutions, Antibodies consulting, IP and chIP methods, Cell counting.
• עדי גרבי השתתפה בקורסים והשתלמויות בתחומים: כרומטוגרפיה, מיקרוסקופיה ומדעי החיים .